Seqüenciació DNA Sanger

Seqüenciació automàtica de DNA

• La seqüenciació automàtica de DNA desenvolupada per Applied Biosystems utilitza la metodologia de Sanger amb una polimerasa termostable que permet una reacció de seqüenciació cíclica.
• El producte de la reacció es separa per electroforesi capil·lar. El marcatge dels fragments es realitza amb 4 fluorocroms (un per cada base). Aquests fluorocroms poden estar incorporats en el primer,"dye primer kit", o bé en els ddNTPs o terminadors, "dye terminator kit".
• El DNA a seqüenciar ha de ser de la màxima qualitat possible, i es pot partir de: productes de PCR, plasmidis o fags. Els primers que s’han d’emprar per a la seqüenciació cíclica poden ser els específics de cada producte de PCR o bé els universals dels plasmidis o fags.

EQUIP

Seqüenciador ABI 3130XL

KIT

BigDye 1.1 ,  BigDye 3.1

MOSTRES

192 mostres/dia (2 plaques)

M13univ: 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'

M13rev: 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'

SP6: 5'-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3'

T7: 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'

T3: 5'-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG-3'

T7term: 5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'

CAPACITAT

16 lectures simultànies fins a unes 800-900 pb

RESULTATS

 S’envien per e-mail els arxius corresponents

ACTIVITAT

CONDICIONS

Electroforesi de les mostres pre-seqüenciades pels usuaris.

El DNA s’ha de portar sec en tubs de 1,5 ml o 0,5 ml, o bé resuspès en placa de 96

Reacció de seqüenciació i posterior electroforesi.

El DNA ha d’estar en aigua a una concentració aproximada de: 20 ng/µl en les PCR i 100 ng/µl en els plasmidis.

El primer també ha d’estar en aigua a una concentració de 3,2-5 pmol/µl.

Preparació i/o purificació del DNA a partir de placa de cultiu (plasmidis) o de reaccions de PCR

Consultar amb el Servei

.

Altres serveis, establint prèviament col·laboracions o convenis.

Consultar amb el Servei