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Real Time PCR (RT-PCR)
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- La PCR en tiempo real permite una cuantificación absoluta o relativa de los niveles de RNA mensajero (mRNA) de una determinada muestra de RNA. El material de partida puede ser tanto RNA total, como de mensajero. En ambos casos, el RNA se retrotranscribe a cDNA.
- La metodología consiste en diseñar unos primers específicos que amplifiquen mediante PCR el fragmento del cual se desea conocer el nivel de expresión. La expresión del fragmento se detecta por fluorescencia con intercalantes (como el SYBRGREEN) o con sondas específicas (como las sondas Taqman). A cada ciclo de PCR se mide la fluorescencia emitida y se obtiene una curva cuando se completan todos los ciclos (normalmente unos 40). Esta curva tiene un valor característico que es el Ct (cycle threshold), del cual valores bajos corresponden a expresión elevada.
- Normalmente se detecta el nivel de expresión de un sólo fragmento. Aún así, se puede detectar simultániamente varios fragmentos para cada muestra, cuando se dispone de un fluorocromo específico para cada fragmento.
- La cuantificación absoluta requiere de la elaboración de una recta patrón con diferentes concentraciones del fragmento que se quiere amplificar.
- A parte de los ensayos de expresión génica, también se pueden llevar a cabo la detección de SNPs i análisis de metilación del DNA.
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EQUIP
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CFX96TM y C1000TM (BioRad)
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SOPORTE DE ENSAYO
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1 placa de 96 pocillos
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MUESTRAS
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El número de muestras por día depende del programa de PCR que se utilice
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CAPACIDAD
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96 muestras simultáneas
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RESULTADOS
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Se envian por e-mail los archivos correspondientes y/o utilitzación del software en el SGB
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ACTIVIDAD
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CONDICIONES
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Ensayo de expresión
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Hay dos ensayos posibles: una etapa o dos etapas. El primero consiste en realizar la retrotranscripción i la PCR sin interrupción. Si se realiza el ensayo en dos etapos, estas se llevan a cabo separadamente. En este caso, el usuario puede optar por realizar la retrotranscripción en su laboratorio.
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Detección de mutaciones
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Existen ensayos específicos para detectar mutaciones puntuales (SNPs) y metilación del DNA. Esta detección se basa en la diferente temperatura de fusión de los productos que se van generando en una PCR. El nombre en inglés de esta técnica es High Resolution Melting (HRM).
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PCR
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Cada usuario puede diseñar el programa de PCR que se ajuste a sus necessidades.
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Análisis
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CFX Manager software .
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