Secuenciación DNA Sanger

Secuenciación automática de DNA

  • La secuenciación automática de DNA desarrollada por Applied Biosystems utiliza la metodología de Sanger con una polimerasa termoestable que permite una reacción de secuenciación cíclica.
  • El producto de la reacción se separa por electroforesis capilar. El marcaje de los fragmentos se realiza con 4 fluorocromos (uno por cada base). Estos fluorocromos pueden estar incorporados en el primer,"dye primer kit", o bien en los ddNTPs o terminadores, "dye terminator kit".
  • El DNA a secuenciar tiene que ser de la máxima cualidad posible, y se puede partir de: productos de PCR, plásmidos o fagos. Los primers que se tienen que usar para la secuenciación cíclica pueden ser los específicos de cada producto de PCR o bien los universales de los plásmidos o fagos.

EQUIPO

Secuenciador ABI 3130XL

KIT

BigDye 1.1 ,  BigDye 3.1

MUESTRAS

192 muestras/día (2 placas)

PRIMERS

El Servei de Genòmica dispone de los siguientes primers:

M13univ: 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'

M13rev: 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'

SP6: 5'-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3'

T7: 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'

T3: 5'-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG-3'

T7term: 5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'

CAPACIDAD

16 lecturas simultaneas hasta 800-900 pb

RESULTADOS

 Se envían por e-mail los archivos correspondientes

 

ACTIVIDAD

CONDICIONES

 

Electroforesis de las muestras pre-secuenciadas por los usuarios

El DNA se tiene que traer seco en tubos de 1,5 ml o 0,5 ml, o bien resuspendidas en placa de 96

 

Reacción de secuenciación y posterior electroforesis

El DNA tiene que estar en agua a una concentración aproximada de: 20 ng/µl en las PCR y 100 ng/µl en los plásmidos.

El primer también tiene que estar en agua a una concentración de 3,2-5 pmol/µl.

 

Preparación y/o purificación del DNA a partir de placa de cultivo (plásmidos) o de reacciones de PCR

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